當(dāng)前所在頁(yè)面：根據(jù)藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求(ICH)中雜質(zhì)的含義, 雜質(zhì)分為有機(jī)雜質(zhì)、無(wú)機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑。有關(guān)物質(zhì)是雜質(zhì)的一種, 主要是指有機(jī)雜質(zhì)。它的檢查方法很多, 而其中的HPLC法具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、分離效果好、靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等諸多優(yōu)點(diǎn), 且能與多種類(lèi)型檢測(cè)器聯(lián)合應(yīng)用, 能滿足大多數(shù)化合物種類(lèi)的檢測(cè)需要, 比較符合有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)雜質(zhì)含量低、種類(lèi)多的特點(diǎn) 。
HPLC法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)中已知雜質(zhì)的測(cè)定方法很多, 計(jì)算方法也相應(yīng)很多,每種計(jì)算方法都有不同的意義及其優(yōu)缺點(diǎn), 下面參考國(guó)內(nèi)外藥品標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)期刊文獻(xiàn), 結(jié)合在藥品檢驗(yàn)中的實(shí)際工作, 對(duì)這些計(jì)算方法作一簡(jiǎn)單探討, 以期為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立或進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)對(duì)有關(guān)物質(zhì)檢查中已知雜質(zhì)的計(jì)算方法的選擇提供借鑒和參考。表1是各種計(jì)算方法的計(jì)算公式及其主要優(yōu)缺點(diǎn)。
一、面積歸一化法
優(yōu)缺點(diǎn)：
具有與稱樣量及進(jìn)樣量基本不相關(guān)的特點(diǎn), 因此重復(fù)性和重現(xiàn)性均良好, 不需要折算, 降低了實(shí)驗(yàn)中對(duì)稱樣量精密度的要求, 降低了檢驗(yàn)成本, 操作更加簡(jiǎn)便、快捷, 省去了計(jì)算過(guò)程。
但當(dāng)雜質(zhì)是微量的時(shí)候需增加方法的靈敏度, 就要增加進(jìn)樣量, 此時(shí)主成分可能超出儀器檢測(cè)范圍, 或雖然在儀器檢測(cè)范圍內(nèi), 理論上講此時(shí)可能與主成分不在同一線性范圍內(nèi)。正是由于各雜質(zhì)的響應(yīng)因子不同、含量較低和需要較寬的線性范圍等因素的影響,《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄中特別強(qiáng)調(diào)“本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外, 一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查” 這也在一定程度上限制了本法的使用。
二、不加校正因子的主成分自身對(duì)照法
此方法是現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》和其他國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)及藥品研發(fā)時(shí)制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用最多、最廣泛的有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法和計(jì)算方法。
方法介紹：
本法是配制一個(gè)濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)墓┰嚻啡芤鹤鳛閷?duì)照溶液, 一般是由供試品溶液直接稀釋得到。本法不需要雜質(zhì)對(duì)照品, 當(dāng)無(wú)法獲得雜質(zhì)對(duì)照品時(shí), 可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法來(lái)計(jì)算雜質(zhì)的含量。
同面積歸一化一樣, 本法也是在假定供試品溶液中所有成分均出峰、所有雜質(zhì)均與主成分分離且各雜質(zhì)和主成分的響應(yīng)因子均相同的前提下進(jìn)行的。
優(yōu)缺點(diǎn)：
同面積歸一化一樣, 本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、運(yùn)算方便, 無(wú)需雜質(zhì)對(duì)照品;缺點(diǎn)是忽略了各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同的事實(shí), 導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)測(cè)得的雜質(zhì)含量可能與真正的雜質(zhì)含量不一致。
此外, 不加校正因子的主成分自身對(duì)照法會(huì)存在稀釋步驟、進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥殘留、進(jìn)樣誤差等影響因素, 往往也會(huì)導(dǎo)致計(jì)算出的雜質(zhì)與真實(shí)含量之間存在一定的誤差；但不加校正因子的主成分自身對(duì)照法可以解決面積歸一化法中可能出現(xiàn)的儀器檢測(cè)范圍和線性范圍問(wèn)題。
三、加校正因子的主成分自身對(duì)照法
目前在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較少, 但在國(guó)外藥品標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用比較廣泛。
方法介紹：
該方法的操作步驟基本與上法相同, 唯一不同的是在計(jì)算時(shí)把雜質(zhì)相當(dāng)于主成分的響應(yīng)因子考慮進(jìn)去。本法相當(dāng)于一個(gè)簡(jiǎn)化的內(nèi)標(biāo)法, 同時(shí)也是對(duì)雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法的簡(jiǎn)化, 即在研究方法學(xué)時(shí), 利用雜質(zhì)對(duì)照品和主成分對(duì)照品, 分別測(cè)定雜質(zhì)和主成分的線性方程, 以斜率之比計(jì)算雜質(zhì)相對(duì)于主成分的校正因子, 此校正因子可直接載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中, 在常規(guī)檢驗(yàn)時(shí)用以校正該雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。在實(shí)際測(cè)定時(shí), 可采用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行雜質(zhì)定位。
優(yōu)缺點(diǎn)：
此法的優(yōu)點(diǎn)是在日常檢驗(yàn)中省去了雜質(zhì)對(duì)照品(特別是在雜質(zhì)不夠穩(wěn)定或?qū)?lái)供應(yīng)有困難時(shí)顯得尤其重要), 同時(shí)又考慮到了雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同所引起的測(cè)定誤差;缺點(diǎn)是相對(duì)保留時(shí)間在不同實(shí)驗(yàn)室間可能有所波動(dòng), 特別是當(dāng)供試品中存在多個(gè)雜質(zhì)而又分離不好時(shí)可能造成雜質(zhì)定位困難。
需要指出的是，如果已知雜質(zhì)對(duì)主成分的相對(duì)響應(yīng)因子超出0.9～1.1范圍時(shí), 宜用加校正因子的主成分自身對(duì)照法或雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法法進(jìn)行計(jì)算。
四、主成分對(duì)照品外標(biāo)法
《美國(guó)藥典》多采用加校正因子或不加校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法來(lái)對(duì)已知雜質(zhì)進(jìn)行計(jì)算。
方法介紹：
主成分對(duì)照品外標(biāo)法包括加不校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法和加校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法。操作、計(jì)算分別與不加校正因子和加校正因子的主成分自身對(duì)照法基本一樣，唯一不同的是前者要用主成分對(duì)照品制備一個(gè)濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照品溶液, 后者是由供試品溶液直接稀釋得到一個(gè)濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照溶液。
優(yōu)缺點(diǎn)：
由于主成分對(duì)照品是經(jīng)過(guò)標(biāo)定的, 其純度或量值會(huì)比較準(zhǔn)確, 而制劑中主成分的實(shí)際含量與標(biāo)示量有時(shí)會(huì)不完全一致, 因此采用對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算出的雜質(zhì)的實(shí)際絕對(duì)含量要比自身對(duì)照法準(zhǔn)確一些。當(dāng)然, 由于本法要使用主成分對(duì)照品，從而導(dǎo)致操作成本會(huì)提高一些, 操作過(guò)程會(huì)繁瑣一些。
五、雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法
方法介紹：
雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法要求提供一定純度的雜質(zhì)對(duì)照品, 分析時(shí)需制備一個(gè)濃度應(yīng)與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛殡s質(zhì)對(duì)照品溶液。由于雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法可以解決上述幾種測(cè)定方法和計(jì)算方法存在的種種問(wèn)題, 特別是雜質(zhì)與主成分響應(yīng)不一致的問(wèn)題, 因此, 本法能反映藥品中該雜質(zhì)的真實(shí)含量。
優(yōu)缺點(diǎn)：
如果雜質(zhì)對(duì)照品容易獲得并能持續(xù)供應(yīng), 建議在有關(guān)物質(zhì)檢查中已知雜質(zhì)的測(cè)定和計(jì)算時(shí)首選該法, 特別是當(dāng)該雜質(zhì)與主成分的相對(duì)響應(yīng)因子相差較大(超出0.9 ～ 1.1范圍)或該雜質(zhì)有毒副作用時(shí), 歐美藥典中采用此法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)計(jì)算的品種也不在少數(shù)。
雖然雜質(zhì)對(duì)照品的獲得和供應(yīng)比較困難, 在國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中是否引入雜質(zhì)對(duì)照品應(yīng)權(quán)衡并慎重, 但由于該法能真實(shí)反映藥品中某一雜質(zhì)的含量, 因此采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法應(yīng)該是今后有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)努力的方向。
六、雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法
方法介紹：
加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法其實(shí)也是雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法的一種。本法的操作方法與測(cè)定方法同雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法一樣, 不同的是在計(jì)算公式中多乘以一個(gè)轉(zhuǎn)換因子, 其意義就是把樣品中某一雜質(zhì)的含量轉(zhuǎn)換成相當(dāng)于主成分本身的重量百分比水平。
假設(shè)某一制劑的標(biāo)示量為100 mg, 采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算出某一雜質(zhì)的含量為主成分的1.0%, 若該雜質(zhì)與主成分的分子量之比為1∶2, 則按加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算出的該雜質(zhì)的含量為2.0%, 即該雜質(zhì)的真實(shí)含量為1.0mg, 但通過(guò)分子量之比換算成相當(dāng)于主成分的含量為2.0mg。
優(yōu)缺點(diǎn)：
結(jié)果較準(zhǔn)確。但由于雜質(zhì)的分子量可能大于或小于主成分的分子量(即主成分的分子量/雜質(zhì)的分子量可能小于1或大于1), 因此采用本法計(jì)算出的某一雜質(zhì)的含量結(jié)果也可能比面積歸一化法、主成分自身對(duì)照法、主成分對(duì)照品外標(biāo)法和雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算出的結(jié)果偏低或偏高。
七、主成分對(duì)照品外標(biāo)法
方法介紹：
加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法其實(shí)也是主成分對(duì)照品外標(biāo)法的一種, 就是在加校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法的基礎(chǔ)上乘以轉(zhuǎn)換因子。
優(yōu)缺點(diǎn)：
其操作和優(yōu)缺點(diǎn)與加校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法一樣, 其意義與加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法一樣, 也是通過(guò)雜質(zhì)和主成分分子量之比的換算把該雜質(zhì)的含量轉(zhuǎn)換成相當(dāng)于主成分本身的百分比水平。
八、內(nèi)標(biāo)法
方法介紹：
按各品種項(xiàng)下的規(guī)定, 分別精密量取含有一定濃度內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對(duì)照品溶液和供試品溶液, 注入液相色譜儀, 記錄色譜圖, 測(cè)定對(duì)照品溶液中對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積及供試品溶液中待測(cè)成分(這里指待測(cè)雜質(zhì))和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積。
優(yōu)缺點(diǎn)：
內(nèi)標(biāo)法主要是為了解決儀器進(jìn)樣精密度和藥物中所含成分的回收率的問(wèn)題, 這種方法可以抵消儀器和過(guò)程帶來(lái)的誤差。但在以常壓六通閥定量環(huán)進(jìn)樣和回收率已經(jīng)驗(yàn)證的情況下, 意義已不大, 加之內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇比較困難, 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的添加會(huì)導(dǎo)致分離難度的增大, 操作過(guò)程更加煩瑣等問(wèn)題, 本法已經(jīng)使用很少。
現(xiàn)舉例說(shuō)明不同計(jì)算方法對(duì)HPLC法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)中已知雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果的影響。抗高血壓藥馬來(lái)酸依那普利片中有關(guān)物質(zhì)的計(jì)算方法。
《中國(guó)藥典》2005年版二部中所有雜質(zhì)(包括已知雜質(zhì)依那普利拉和依那普利雙酮)采用的均是不加校正因子的主成分自身對(duì)照法 ;
《英國(guó)藥典》2008年版中已知雜質(zhì)依那普利拉和依那普利雙酮采用的是雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法, 其他雜質(zhì)采用的是不加校正因子的主成分自身對(duì)照法;
《英國(guó)藥典》31 版中已知雜質(zhì)依那普利拉采用的是加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法, 依那普利雙酮采用的是加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法, 其他雜質(zhì)采用的是不加校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法。
由于不同計(jì)算方法所表示的意義不同, 所以得出的結(jié)果也不相同。表2 就是某企業(yè)生產(chǎn)的馬來(lái)酸依那普利片, 按上述不同計(jì)算方法得出的雜質(zhì)的含量結(jié)果。
由表2可知, 不同的計(jì)算方法得出有關(guān)物質(zhì)中已知雜質(zhì)和總雜質(zhì)的含量不盡相同, 如果采用統(tǒng)一的限度, 就會(huì)出現(xiàn)同一雜質(zhì)采用不同的計(jì)算方法, 結(jié)果在有些情況下符合規(guī)定, 而有些情況下不符合規(guī)定的現(xiàn)象, 這種情況下只能根據(jù)不同的計(jì)算方法和有關(guān)要求制訂合理的限度。
隨著液相色譜技術(shù)的進(jìn)一步完善, 新型檢測(cè)器的不斷開(kāi)發(fā), 以及各種類(lèi)型檢測(cè)器的聯(lián)合應(yīng)用, HPLC將在有關(guān)物質(zhì)檢查中發(fā)揮更大的作用。
