當前所在頁面：根據藥品注冊的國際技術要求(ICH)中雜質的含義, 雜質分為有機雜質、無機雜質和殘留溶劑。有關物質是雜質的一種, 主要是指有機雜質。它的檢查方法很多, 而其中的HPLC法具有專屬性強、分離效果好、靈敏度高、分析速度快、重復性好、操作簡便等諸多優點, 且能與多種類型檢測器聯合應用, 能滿足大多數化合物種類的檢測需要, 比較符合有關物質檢查時雜質含量低、種類多的特點 。
HPLC法測定有關物質中已知雜質的測定方法很多, 計算方法也相應很多,每種計算方法都有不同的意義及其優缺點, 下面參考國內外藥品標準和相關期刊文獻, 結合在藥品檢驗中的實際工作, 對這些計算方法作一簡單探討, 以期為藥品質量標準的建立或進行相關研究時對有關物質檢查中已知雜質的計算方法的選擇提供借鑒和參考。表1是各種計算方法的計算公式及其主要優缺點。
一、面積歸一化法
優缺點：
具有與稱樣量及進樣量基本不相關的特點, 因此重復性和重現性均良好, 不需要折算, 降低了實驗中對稱樣量精密度的要求, 降低了檢驗成本, 操作更加簡便、快捷, 省去了計算過程。
但當雜質是微量的時候需增加方法的靈敏度, 就要增加進樣量, 此時主成分可能超出儀器檢測范圍, 或雖然在儀器檢測范圍內, 理論上講此時可能與主成分不在同一線性范圍內。正是由于各雜質的響應因子不同、含量較低和需要較寬的線性范圍等因素的影響,《中國藥典》2005年版二部附錄中特別強調“本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規定外, 一般不宜用于微量雜質的檢查” 這也在一定程度上限制了本法的使用。
二、不加校正因子的主成分自身對照法
此方法是現行版《中國藥典》和其他國家藥品標準及藥品研發時制定的質量標準中應用最多、最廣泛的有關物質的測定方法和計算方法。
方法介紹：
本法是配制一個濃度與雜質限度相當的供試品溶液作為對照溶液, 一般是由供試品溶液直接稀釋得到。本法不需要雜質對照品, 當無法獲得雜質對照品時, 可采用不加校正因子的主成分自身對照法來計算雜質的含量。
同面積歸一化一樣, 本法也是在假定供試品溶液中所有成分均出峰、所有雜質均與主成分分離且各雜質和主成分的響應因子均相同的前提下進行的。
優缺點：
同面積歸一化一樣, 本法的優點是操作簡單、運算方便, 無需雜質對照品;缺點是忽略了各雜質與主成分的響應因子可能不同的事實, 導致了實驗測得的雜質含量可能與真正的雜質含量不一致。
此外, 不加校正因子的主成分自身對照法會存在稀釋步驟、進樣針和進樣閥殘留、進樣誤差等影響因素, 往往也會導致計算出的雜質與真實含量之間存在一定的誤差；但不加校正因子的主成分自身對照法可以解決面積歸一化法中可能出現的儀器檢測范圍和線性范圍問題。
三、加校正因子的主成分自身對照法
目前在國內應用較少, 但在國外藥品標準中應用比較廣泛。
方法介紹：
該方法的操作步驟基本與上法相同, 唯一不同的是在計算時把雜質相當于主成分的響應因子考慮進去。本法相當于一個簡化的內標法, 同時也是對雜質對照品外標法的簡化, 即在研究方法學時, 利用雜質對照品和主成分對照品, 分別測定雜質和主成分的線性方程, 以斜率之比計算雜質相對于主成分的校正因子, 此校正因子可直接載入質量標準中, 在常規檢驗時用以校正該雜質的實測峰面積。在實際測定時, 可采用相對保留時間進行雜質定位。
優缺點：
此法的優點是在日常檢驗中省去了雜質對照品(特別是在雜質不夠穩定或將來供應有困難時顯得尤其重要), 同時又考慮到了雜質與主成分的響應因子可能不同所引起的測定誤差;缺點是相對保留時間在不同實驗室間可能有所波動, 特別是當供試品中存在多個雜質而又分離不好時可能造成雜質定位困難。
需要指出的是，如果已知雜質對主成分的相對響應因子超出0.9～1.1范圍時, 宜用加校正因子的主成分自身對照法或雜質對照品外標法法進行計算。
四、主成分對照品外標法
《美國藥典》多采用加校正因子或不加校正因子的主成分對照品外標法來對已知雜質進行計算。
方法介紹：
主成分對照品外標法包括加不校正因子的主成分對照品外標法和加校正因子的主成分對照品外標法。操作、計算分別與不加校正因子和加校正因子的主成分自身對照法基本一樣，唯一不同的是前者要用主成分對照品制備一個濃度與雜質限度相當的溶液作為對照品溶液, 后者是由供試品溶液直接稀釋得到一個濃度與雜質限度相當的溶液作為對照溶液。
優缺點：
由于主成分對照品是經過標定的, 其純度或量值會比較準確, 而制劑中主成分的實際含量與標示量有時會不完全一致, 因此采用對照品外標法計算出的雜質的實際絕對含量要比自身對照法準確一些。當然, 由于本法要使用主成分對照品，從而導致操作成本會提高一些, 操作過程會繁瑣一些。
五、雜質對照品外標法
方法介紹：
雜質對照品外標法要求提供一定純度的雜質對照品, 分析時需制備一個濃度應與雜質限度相當的溶液作為雜質對照品溶液。由于雜質對照品外標法可以解決上述幾種測定方法和計算方法存在的種種問題, 特別是雜質與主成分響應不一致的問題, 因此, 本法能反映藥品中該雜質的真實含量。
優缺點：
如果雜質對照品容易獲得并能持續供應, 建議在有關物質檢查中已知雜質的測定和計算時首選該法, 特別是當該雜質與主成分的相對響應因子相差較大(超出0.9 ～ 1.1范圍)或該雜質有毒副作用時, 歐美藥典中采用此法進行有關物質計算的品種也不在少數。
雖然雜質對照品的獲得和供應比較困難, 在國家藥品標準中是否引入雜質對照品應權衡并慎重, 但由于該法能真實反映藥品中某一雜質的含量, 因此采用雜質對照品外標法應該是今后有關物質檢查時努力的方向。
六、雜質對照品外標法
方法介紹：
加轉換因子的雜質對照品外標法其實也是雜質對照品外標法的一種。本法的操作方法與測定方法同雜質對照品外標法一樣, 不同的是在計算公式中多乘以一個轉換因子, 其意義就是把樣品中某一雜質的含量轉換成相當于主成分本身的重量百分比水平。
假設某一制劑的標示量為100 mg, 采用雜質對照品外標法計算出某一雜質的含量為主成分的1.0%, 若該雜質與主成分的分子量之比為1∶2, 則按加轉換因子的雜質對照品外標法計算出的該雜質的含量為2.0%, 即該雜質的真實含量為1.0mg, 但通過分子量之比換算成相當于主成分的含量為2.0mg。
優缺點：
結果較準確。但由于雜質的分子量可能大于或小于主成分的分子量(即主成分的分子量/雜質的分子量可能小于1或大于1), 因此采用本法計算出的某一雜質的含量結果也可能比面積歸一化法、主成分自身對照法、主成分對照品外標法和雜質對照品外標法計算出的結果偏低或偏高。
七、主成分對照品外標法
方法介紹：
加轉換因子和校正因子的主成分對照品外標法其實也是主成分對照品外標法的一種, 就是在加校正因子的主成分對照品外標法的基礎上乘以轉換因子。
優缺點：
其操作和優缺點與加校正因子的主成分對照品外標法一樣, 其意義與加轉換因子的雜質對照品外標法一樣, 也是通過雜質和主成分分子量之比的換算把該雜質的含量轉換成相當于主成分本身的百分比水平。
八、內標法
方法介紹：
按各品種項下的規定, 分別精密量取含有一定濃度內標物質的對照品溶液和供試品溶液, 注入液相色譜儀, 記錄色譜圖, 測定對照品溶液中對照品和內標物質的峰面積及供試品溶液中待測成分(這里指待測雜質)和內標物質的峰面積。
優缺點：
內標法主要是為了解決儀器進樣精密度和藥物中所含成分的回收率的問題, 這種方法可以抵消儀器和過程帶來的誤差。但在以常壓六通閥定量環進樣和回收率已經驗證的情況下, 意義已不大, 加之內標物質的選擇比較困難, 內標物質的添加會導致分離難度的增大, 操作過程更加煩瑣等問題, 本法已經使用很少。
現舉例說明不同計算方法對HPLC法測定有關物質中已知雜質測定結果的影響。抗高血壓藥馬來酸依那普利片中有關物質的計算方法。
《中國藥典》2005年版二部中所有雜質(包括已知雜質依那普利拉和依那普利雙酮)采用的均是不加校正因子的主成分自身對照法 ;
《英國藥典》2008年版中已知雜質依那普利拉和依那普利雙酮采用的是雜質對照品外標法, 其他雜質采用的是不加校正因子的主成分自身對照法;
《英國藥典》31 版中已知雜質依那普利拉采用的是加轉換因子的雜質對照品外標法, 依那普利雙酮采用的是加轉換因子和校正因子的主成分對照品外標法, 其他雜質采用的是不加校正因子的主成分對照品外標法。
由于不同計算方法所表示的意義不同, 所以得出的結果也不相同。表2 就是某企業生產的馬來酸依那普利片, 按上述不同計算方法得出的雜質的含量結果。
由表2可知, 不同的計算方法得出有關物質中已知雜質和總雜質的含量不盡相同, 如果采用統一的限度, 就會出現同一雜質采用不同的計算方法, 結果在有些情況下符合規定, 而有些情況下不符合規定的現象, 這種情況下只能根據不同的計算方法和有關要求制訂合理的限度。
隨著液相色譜技術的進一步完善, 新型檢測器的不斷開發, 以及各種類型檢測器的聯合應用, HPLC將在有關物質檢查中發揮更大的作用。
