當前所在頁面：一、染色原理與方法
1、染色原理
由于微生物細胞含有大量水分，機體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差，必須進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態和結構。
微生物中細菌、致病菌是很小的生物體，必須通過染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。
2、染色方法
①簡單染色法
簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細菌染上顏色，觀察細菌的形態。
②復染色法
用兩種或多種染料染細菌，目的是為了鑒別不同性質的細菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。
3、革蘭氏染色法
①原理
革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫師Gram創立。
染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；
染色反應呈紅色的稱為革蘭氏陰性細菌，用G―表示。
細菌對革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。
②細菌的革蘭氏染色步驟
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復染→水洗→干燥→觀察
A）取培養物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同；
B）用草酸銨結晶紫染色1min后水洗；
C）加碘液媒染1min后水洗；
D）斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現紫色為止，大約需時20～30s，隨即水洗；
E）用蕃紅染液復染30s，水洗；
F）用吸水紙吸掉水滴，待標本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發現目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。
二、影響革蘭氏染色結果準確性的關鍵因素
1.試劑影響。
這是我們首先應該確保的，我們使用的試劑必須是有效的。實驗室應當建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗收到存放、使用、過期后的廢棄處理都應有嚴格規定，確保我們使用的試劑是有效的。工欲善其事必先利其器，這也是我們試驗成功最基礎的一環。
2.染色菌的選擇。
菌齡對革蘭氏染色結果的影響是十分大的。我們染色過程中選擇的菌應該是處于活躍生長期，這樣的細菌活性強，生理特征明顯，所以染色的結果準確度高，一般情況下不會出現誤差。培養時間較長的革蘭氏陽性菌，由于細胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經死亡或者自行溶解了，造成細胞壁通透性增加，就會呈現出假陰性。以金黃色葡萄球菌為例，金葡是典型的革蘭氏陽性菌，有人曾經統計過培養至不同時間的金葡的革蘭氏染色結果，結果表明，在金葡活躍期的22h-26h之間，染色結果的準確率基本可以達到100%，而超過26h之后，準確率就開始下降，培養至36h時，準確率大概會下降30%左右。所以我們在染色時，一定要選擇處于活躍期、活性較強的菌落，在檢測過程中一定要嚴格的在國標要求的時間段內進行染色試驗，不能提前或者延后。
3.涂菌的狀態。
在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應該在無菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過程中，若是菌體堆積，也會極大影響染色結果的準確性。菌落堆積過多，往往菌體之間變得毫無縫隙，而其細胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產生假陽性的結果。同時，在初染、媒染及復染的過程中，應將染液覆蓋整個菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。因此在涂片過程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達到最佳效果。
4.媒染時間。
媒染時間對革蘭氏陰性菌的染色結果有很大影響。由于媒染時間過長，結晶紫在碘液長時間作用下過分牢固結合在菌體細胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會導致這種假陽性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過統計，媒染時間嚴格控制在40s-60s之內，染色結果準確率基本可達到100%，而超過60s準確率會有一定的降低，若媒染超過100s，準確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過程中一定要注意媒染時間，控制在50-60s為宜。
5.酒精脫色。
酒精脫色也是一個對結果影響較大的操作過程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌最主要的差異是細胞壁肽聚糖層厚度和結構，革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時，細菌細胞壁的多糖成分會被酒精溶解，增大了細胞壁的通透性，結晶紫及碘復合物就很快被酒精洗脫，之后就會被沙黃復染呈紅色；而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無法進入，這樣結晶紫和復合物就無法洗脫出來使細胞呈紫色。因此，酒精脫色時間短，脫色效果不佳，會導致陰性菌菌體內的結晶紫和復合物不能有效的全部洗脫出來，就會出現明顯的誤差，使陰性菌出現假陽性。而洗脫時間過長，也會導致陽性菌的細胞壁被酒精破壞，導致細胞內的紫色被洗脫，呈現假陰性。因此洗脫時間也是革蘭氏染色的關鍵環節。洗脫時間應當嚴格控制在20s-30s之間，同時保證洗脫效果。
在整個革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴格控制的幾個方面：染色菌必須是在其活躍期內，涂布狀態不可太厚，媒染時間嚴格控制在50s-60s之間，脫色時間嚴格控制在20s-30s。
