當(dāng)前所在頁(yè)面：一、染色原理與方法
1、染色原理
由于微生物細(xì)胞含有大量水分，機(jī)體是無(wú)色透明的，與周圍背景沒(méi)有明顯的反差，必須進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
微生物中細(xì)菌、致病菌是很小的生物體，必須通過(guò)染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過(guò)染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長(zhǎng)有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。
2、染色方法
①簡(jiǎn)單染色法
簡(jiǎn)單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，觀察細(xì)菌的形態(tài)。
②復(fù)染色法
用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。
3、革蘭氏染色法
①原理
革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。
染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用G+表示；
染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G―表示。
細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。
②細(xì)菌的革蘭氏染色步驟
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復(fù)染→水洗→干燥→觀察
A）取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡(jiǎn)單染色的相同；
B）用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗；
C）加碘液媒染1min后水洗；
D）斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時(shí)20～30s，隨即水洗；
E）用蕃紅染液復(fù)染30s，水洗；
F）用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。
二、影響革蘭氏染色結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素
1、試劑影響。這是我們首先應(yīng)該確保的，我們使用的試劑必須是有效的。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗(yàn)收到存放、使用、過(guò)期后的廢棄處理都應(yīng)有嚴(yán)格規(guī)定，確保我們使用的試劑是有效的。工欲善其事必先利其器，這也是我們?cè)囼?yàn)成功最基礎(chǔ)的一環(huán)。
2、染色菌的選擇。菌齡對(duì)革蘭氏染色結(jié)果的影響是十分大的。我們?nèi)旧^(guò)程中選擇的菌應(yīng)該是處于活躍生長(zhǎng)期，這樣的細(xì)菌活性強(qiáng)，生理特征明顯，所以染色的結(jié)果準(zhǔn)確度高，一般情況下不會(huì)出現(xiàn)誤差。培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，由于細(xì)胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經(jīng)死亡或者自行溶解了，造成細(xì)胞壁通透性增加，就會(huì)呈現(xiàn)出假陰性。以金黃色葡萄球菌為例，金葡是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌，有人曾經(jīng)統(tǒng)計(jì)過(guò)培養(yǎng)至不同時(shí)間的金葡的革蘭氏染色結(jié)果，結(jié)果表明，在金葡活躍期的22h-26h之間，染色結(jié)果的準(zhǔn)確率基本可以達(dá)到100%，而超過(guò)26h之后，準(zhǔn)確率就開(kāi)始下降，培養(yǎng)至36h時(shí)，準(zhǔn)確率大概會(huì)下降30%左右。所以我們?cè)谌旧珪r(shí)，一定要選擇處于活躍期、活性較強(qiáng)的菌落，在檢測(cè)過(guò)程中一定要嚴(yán)格的在國(guó)標(biāo)要求的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行染色試驗(yàn)，不能提前或者延后。
3、涂菌的狀態(tài)。在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應(yīng)該在無(wú)菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過(guò)程中，若是菌體堆積，也會(huì)極大影響染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。菌落堆積過(guò)多，往往菌體之間變得毫無(wú)縫隙，而其細(xì)胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。同時(shí)，在初染、媒染及復(fù)染的過(guò)程中，應(yīng)將染液覆蓋整個(gè)菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒(méi)有染色。因此在涂片過(guò)程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達(dá)到最佳效果。
4、媒染時(shí)間。媒染時(shí)間對(duì)革蘭氏陰性菌的染色結(jié)果有很大影響。由于媒染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，結(jié)晶紫在碘液長(zhǎng)時(shí)間作用下過(guò)分牢固結(jié)合在菌體細(xì)胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會(huì)導(dǎo)致這種假陽(yáng)性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過(guò)統(tǒng)計(jì)，媒染時(shí)間嚴(yán)格控制在40s-60s之內(nèi)，染色結(jié)果準(zhǔn)確率基本可達(dá)到100%，而超過(guò)60s準(zhǔn)確率會(huì)有一定的降低，若媒染超過(guò)100s，準(zhǔn)確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過(guò)程中一定要注意媒染時(shí)間，控制在50-60s為宜。
5、酒精脫色。酒精脫色也是一個(gè)對(duì)結(jié)果影響較大的操作過(guò)程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌最主要的差異是細(xì)胞壁肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖成分會(huì)被酒精溶解，增大了細(xì)胞壁的通透性，結(jié)晶紫及碘復(fù)合物就很快被酒精洗脫，之后就會(huì)被沙黃復(fù)染呈紅色；而陽(yáng)性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無(wú)法進(jìn)入，這樣結(jié)晶紫和復(fù)合物就無(wú)法洗脫出來(lái)使細(xì)胞呈紫色。因此，酒精脫色時(shí)間短，脫色效果不佳，會(huì)導(dǎo)致陰性菌菌體內(nèi)的結(jié)晶紫和復(fù)合物不能有效的全部洗脫出來(lái)，就會(huì)出現(xiàn)明顯的誤差，使陰性菌出現(xiàn)假陽(yáng)性。而洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁被酒精破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的紫色被洗脫，呈現(xiàn)假陰性。因此洗脫時(shí)間也是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。洗脫時(shí)間應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制在20s-30s之間，同時(shí)保證洗脫效果。
在整個(gè)革蘭氏染色過(guò)程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴(yán)格控制的幾個(gè)方面：染色菌必須是在其活躍期內(nèi)，涂布狀態(tài)不可太厚，媒染時(shí)間嚴(yán)格控制在50s-60s之間，脫色時(shí)間嚴(yán)格控制在20s-30s。
