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平板劃線分離法
平板劃線分離法：是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面，通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種。有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離目的的。
為方便劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有分區(qū)劃線法和連續(xù)劃線法兩種（如圖1， A、B）。
圖1
分區(qū)劃線法是將平板分四區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。劃線時(shí)每次將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60~70°劃線，每換一次角度，應(yīng)將接種環(huán)上的菌燒死后，再通過上次劃線處劃線；另一種連續(xù)劃線法是從平板邊緣一點(diǎn)開始，連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當(dāng)中不需灼燒接種環(huán)上的菌。
1、連續(xù)劃線法
接種環(huán)于酒精燈外焰燒至紅透，接種棒也要充分灼燒，最后再集中燒接種環(huán)至紅。
輕輕搖勻待接種試管，左手手心托待接種試管底側(cè)部，右手執(zhí)接種環(huán)，右手小指拔下試管塞，于酒精燈附近將接種環(huán)伸進(jìn)試管，稍候，再插入待接接種液中，蘸一下，取滿一環(huán)，抽出、燒塞、蓋蓋、放回試管架。或?qū)⒔臃N環(huán)通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻，然后以無菌操作接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。
于靠近酒精燈處打開平皿蓋約30°，右手將環(huán)伸進(jìn)平皿，將菌種點(diǎn)種在平板邊緣一處，輕輕涂布于瓊脂培養(yǎng)基邊緣（如圖2），抽出接種環(huán)，蓋上平皿蓋，然后將接種環(huán)上多余的培養(yǎng)液在火焰中灼燒，打開平皿蓋約30°伸入接種環(huán)，待接種環(huán)冷卻后，再與接種液處輕輕接觸，開始在平板表面輕巧滑動(dòng)劃線，接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊，劃線完畢，關(guān)上皿蓋。灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（以免培養(yǎng)過程皿蓋冷凝水滴下，沖散已分離的菌落）。培養(yǎng)后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài)，鏡檢后再接種斜面。
圖2
2、分區(qū)劃線法
取菌、接種、培養(yǎng)方法與“連續(xù)劃線法”相似。
分區(qū)劃線法分離時(shí)平板分四個(gè)區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。其中第4區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為防止第4區(qū)內(nèi)劃線與1、2、3區(qū)線條相接觸，應(yīng)使4區(qū)線條與1區(qū)線條相平行，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120°左右。
先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃3~5條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋，將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60~70°，右手把接種環(huán)上多余菌體燒死，將燒紅的接種環(huán)在平板邊緣冷卻，再按以上方法以1區(qū)劃線的菌體為菌源，由1區(qū)向2區(qū)作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時(shí)再把平皿轉(zhuǎn)動(dòng)約60~70°，同樣依次在3、4區(qū)劃線。劃線完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，同上法培養(yǎng)，在劃線區(qū)觀察單菌落。
二
斜面接種法
該法主要用于單個(gè)菌落的純培養(yǎng)、保存菌種或觀察細(xì)菌的某些特性。
（1）左手平托兩支試管，拇指按住試管的底部。外側(cè)一支試管是斜面上長有菌苔的菌種試管，內(nèi)側(cè)一支是待接的空白斜面，兩支試管的斜面同時(shí)向上。用右手將試管塞旋松，以便在接種時(shí)容易拔出。
（2）右手拿接種環(huán)（如握毛筆一樣），在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌。
（3）將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指和掌心將兩支試管的試管塞一并夾住拔出，試管塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。注意不得將試管塞隨意丟于桌上受到沾污，試管口切勿燒得過燙以免炸裂。
（4）將已灼燒的接種環(huán)伸入外側(cè)的菌種試管內(nèi)。先把接種環(huán)的先端觸及無菌苔的培養(yǎng)基上使其冷卻（如果操作迅速，此時(shí)接種環(huán)尚未完全冷卻）。再根據(jù)需要用接種環(huán)沾取一定量的菌苔，注意勿刮破培養(yǎng)基。將沾有菌苔的接種環(huán)迅速抽出試管，注意勿使接種環(huán)碰到管壁或管口上。
（5）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管的底部，輕輕向上劃線（直線或曲線，根據(jù)需要確定），勿劃破培養(yǎng)基表面。
（6）接好種的斜面試管口再次過火焰，試管塞底部過火焰后立即塞入試管內(nèi)。
（7）將沾有菌苔的接種環(huán)在火焰上燒紅滅菌。先在內(nèi)焰中燒灼，使其干燥后，再在外焰中燒紅，以免菌苔驟熱，會(huì)使菌體爆濺，造成污染。
（8）放下環(huán)后，再將試管塞旋緊，在試管外面上方距試管口2～3cm處貼上標(biāo)簽。
斜面接種方法及無菌操作過程如下具體操作過程見圖3。
圖3
三
穿刺接種法
用接種針經(jīng)火焰滅菌，沾取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部，然后將挑起菌落的接種針平行于管壁插入瓊脂斜面底部、沿著原接種線將針拔出、燒試管塞和試管口、塞上試管塞，再將接種針上殘留的菌體在火焰上燒掉。要做到手穩(wěn)、動(dòng)作輕巧快速。見下圖4。（a:垂直接種法，b：水平接種法）
四
液體和半固體接種法
1、液體接種法
包括從外面菌種接入培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，要求無菌操作。
左手持試管，右手將燒灼過的接種環(huán)伸入菌種管，待冷卻后，取菌液一環(huán)，立即移入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，然后將試管稍傾斜，并沾取少許液體調(diào)和，使菌液混合于培養(yǎng)基中。
2、半固體培養(yǎng)基接種法
將燒灼過的接種針插入菌種管冷卻后，沾取菌液少許，立即垂直插入半固體培養(yǎng)基的中心至接近于管底處，但不可直刺至管底，然后循原路退出。管口通過火焰，塞上棉塞，接種針燒灼滅菌后放下。
將上述已接種好的培養(yǎng)物，37℃度恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，24小時(shí)后取出觀察結(jié)果。
五
涂布接種
用無菌移液管吸取菌懸液0.1mL，滴加于培養(yǎng)基平板上，右手持無菌涂布棒，左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，在火焰旁右手持涂布棒與培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴(kuò)散，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破。接種后，將平板倒置于恒溫箱中，培養(yǎng)觀察。
